Die papierchromatographische Methode hat auf Grund ihres relativ geringen apparativen Aufwandes, des zu erzielenden hohen Trenneffektes und der zur Analyse benötigten geringen Substanzmengen neue Aspekte für die biochemische Analyse im biologischen Laboratorium geboten. Zahlreiche Probleme sind in Angriff genommen worden, die auf Grund des geringen zur Verfügung stehenden Ausgangsmaterials einer experi mentellen Untersuchung früher nicht zugänglich waren. Vorliegende Dar stellung bringt in 2. Auflage die Anwendung papierchromatographischer Techniken für diejenigen Substanzen, die im Rahmen botanisch-bio chemischer Fragestellungen von Interesse sind. Die Bearbeiter verfügen jeweils über eigene experimentelle Erfahrung im Bereich der dargestellten Stoffgruppe. Die Methoden und ihre Anwendung auf pflanzliche Objekte sind so ausführlich dargestellt, daß ein Nacharbeiten im allgemeinen ohne Hinzuziehen der Originalliteratur möglich ist. Es wurde wiederum nicht angestrebt, alle bisher beschriebenen Methoden zu erfassen. Vielmehr sind die brauchbarsten und erprobten Arbeitsgänge unter besonderer Berück sichtigung der Aufarbeitungsverfahren zusammengetragen. Bezüglich einer ausführlichen theoretischen Grundlegung und der zahlreichen ständig neu entwickelten apparativen Möglichkeiten sei auf die zusammenfassenden Darstellungen in der Bibliographie verwiesen. Mit allem Nachdruck muß wiederum auf die Grenze der papier chromatographischen Methodik hingewiesen werden. Es hat sich in den vergangenen Jahren gezeigt, daß sie zwar eine bedeutsame Erweiterung des methodischen Repertoirs besonders für den Biologen darstellt, jedoch keineswegs die klassischen Verfahren der Mikroanalyse überflüssig macht.

Allgemeiner Teil

A. Theorie der Papierchromatographie
1. Einleitung
2. Die Craig-Methode
3. Papierchromatographie
Literatur
B. Einrichtung eines papierchromatographischen Laboratoriums
1. Arbeitsraum
2. Dunkelraum
3. Chromatographieraum
C. Techniken
I. Eindimensionales Verfahren
1. Die absteigende Methode
2. Die aufsteigende Methode
3. Die Mikromethode
II. Zweidimensionale Verfahren
III. Mehrdimensionale Verfahren
IV. Rundfilter-Technik
V. Präparative Papierchromatographie
VI. Papierelektrophorese
D. Papiere
Sonderpapiere
1. Hydrophobierte Papiere
2. Carboxyl-Papiere
3. Austauscher-Papiere
E. Aufbereitung
I. Extraktion
II. Störsubstanzen
1. Entsalzen
2. Entfernen von Lipoiden
3. Entfernen von Eiweiß
III. Einengen
F. Auftragen und Trocknen
G. Fehlerquellen
H. Auswertung und Dokumentation
Literatur
J. Isotopentechnik
I. Qualitative Technik
1. Lokalisierung durch Autoradiographie
Arbeitsgänge zur Identifizierung unbekannter radioaktiver Substanzen in einem Gemisch
a) Einbau der Isotopen in den pflanzlichen Organismus
b) Extraktion und Identifikation
2. Zählrohrtechnik
Analyse einer Mischung von Stoffen mit der Leitisotopen-Technik
a) Identifizierung nicht markierter Stoffe mit der LeitisotopDerivat-Technik
b) Identifizierung von nicht-markierten Substanzen durch Reaktion mit einem radioaktiven Reagens
II. Quantitative Technik
1. Interpretation des Chromatogramms
a) N ullettekt ("background activity")
b) Handhabung der Proben
c) Absorption und Selbst-Absorption der Strahlung
d) Intensitätsbefall
2. Quantitative Bestimmungen
a) Isotop-Derivat-Indicator-Technik
b) Kupfer-Chelat-Technik
Literatur
Spezieller Teil
A. Anorganische Kationen und Anionen
I. Aufbereitung des Materials
1. Trockene Veraschung
2. Nasse Veraschung
a) Mit rauchender Salpetersäure
b) Mit konz. Schwefelsäure
c) Mit rauchender Salpetersäure und konz. Schwefelsäure
3. Soda-Schmelze zur Bestimmung der Anionen
II. Papier, Geräte
1. Papier und dessen Reinigung
2. Pipetten, Büretten
III. Met hode
IV Lösungsmittel und RF-Werte
V. Nachweis
1. Physikalische Methoden
a) Radioaktive Isotope
b) Colorimetrische Methode
c) Spektrographische Analyse
2. Chemische Methoden
VI. Quantitative Bestimmungsmethoden
1. Bestimmung auf dem Papier
a) Auf Grund der Fleckengröße
b) Durch Intensitätsmessung
2. Isolierung der getrennten Substanzen und anschließende Bestimmung
3. Spezielle quantitative Methoden
a) Alkali- und Erdalkali-Ionen
b) Bestimmung von Molybdän
c) Bestimmung von Kupfer und Eisen
Literatur
B. Kohlenhydrate
I. Mono-, Oligosaccharide
1. Verarbeitung des Pflanzenmaterials
2. Trennung der Zuckergemische. Lösungsmittel
3. Nachweis der Zucker
a) Ammoniakalisches Silbernitrat
b) Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)
c) 3,4-Dinitro-benzoesäure
d) 3,5-Dinitrosalicylsäure
e) Kaliumferricyanid
f) Natriumperjodat
g) Kaliumpermanganat
h) Naphthoresorcin-Trichloressigsäure
i) Naphthoresorcin-Phosphorsäure
k) Orcin-Trichloressigsäure
l) Phloroglucin-Trichloressigsäure
m) Anilin-Phthalsäure
n) Anilin-Phosphorsäure
o) m-Phenylendiamin
p) p-Amino-dimethylanilin
q) p-Anisidin-Phosphorsäure
r) ?-Naphthylamin
s) Benzidin-Trichloressigsäure
t) p-Amino-Hippursäure
u) Harnstoff-Salzsäure
v) Dinitrophenylhydrazin
4. Quantitative Bestimmung
a) Visueller Vergleich
b) Bestimmung nach der Fleckengröße
c) Photometrische Bestimmung des gebildeten Farbstoffes
d) Extraktion des Zuckers und anschließende Mikrobestimmung
?) Oxydation mit dem Kupferreagens nach Somogyi
?) Perj odat-Oxydation
?) Colorimetrische Bestimmung nach Somogyi-Nelson
?) Colorimetrische Bestimmung mit Anilin-Phthalsäure
?) Colorimetrische Bestimmung mit Diphenylamin
?) Colorimetrische Bestimmung mit Anthron
II. Zucker-Derivate
1. Uronsäuren
2. Zuckeralkohole
3. Aminozucker
4. Zucker-Phosphorsaure-Ester
5. Methylzucker
III. Polysaccharide
Literatur
C. Organische Säuren
I. Aufbereitung
1. Extraktionsmittel
2. Entfernung von Begleitsubstanzen
II. Zweckmäßige Technik
1. Papiersorten
2. Lösungsmittel
a) Saure Lösungsmittelsysteme
b) Basische Lösungsmittelsysteme
c) Lösungsmittel zur Trennung von Säurederivaten
3. Reinigung der Lösungsmittel -
III. Trennung der niederen Fettsäuren
1. Hydroxamsäuren
2. Hydrazide
IV. Trennung nichtflüchtiger aliphatischer Säuren
V. Trennung höherer Fettsäuren
1. Fettsäuren in unveresterter Form
a) Trennung der Fettsäuren von C 10 bis C 26
b) Trennung der Fettsäuren von C 16 bis C 32 nach dem Allylester-Verfahren
2. Bestimmung von esterartig gebundenen Fettsäuren
VI. Trennung der Ketosäuren
1. Trennung als Chinoxalin-Derivate
2. Trennung als 2,4-Dinitrophenylhydrazone
3. Trennung als Aminosäuren
VII. Trennung aromatischer Säuren
VIII. Quantitative Verfahren zur Bestimmung organischer Säuren
1. Auswertung der Fleckengröße
2. Photometrische Bestimmung des gebildeten Farbstoffes
3. Andere quantitative Bestimmungsmöglichkeiten
Literatur
IX. Flechtensäuren
1. Aufbereitung
a) Extraktion
b Hydrolyse
?) Alkalische Hydrolyse
?) Saure Hydrolvse
2. Zweckmäßigenik
a) Imprägnierung von Papier
b) Chromatographie
3. Nachweis
4. Dokumentation
5. Fehlerquellen
Literatur
D. Phosphatide und komplexe Lipide
I. Verarbeitung des Pflanzenmaterials
II. Papierchromatographie
1. Lösungsmittel
2. Chromatogramme
3. Nachweisreaktionen
III. Papierelektrophorese
Literatur
E. Proteine und ihre Bausteine
I. Aminosäuren
1. Die Analysenlösung
a) Extraktion von Aminosäuren
b) Eiweißhydrolyse
c) Entsalzung
2. Qualitativer Nachweis
a) Chromatographierpapier
b) Chromatographiergefäße
c) Lösungsmittel
d) Zweidimensionale Trennungen
e) Eindimensionale Trennungen
f) Farbreaktionen der Aminosäuren auf Filterpapier
g) Die Unterscheidung von D- und L-Formen der Aminosäuren
h) Identifizierung der -Farbflecken auf den Chromatogrammen
i) Einige Ergebnisse
3. Quantitative Bestimmung
a) Photometrierung des Kupferkomplexes der Ninhydrinfärbung in Lösung
b) Direkte 1Photometrierung der Farbstoffe auf dem Papier
c) Die "Maximum Density"-Methode
d) Extraktion der Aminosäuren aus dem Papier und Umsetzung mit Ninhydrin in Lösung
e) Photometrierung von DISP-Aminosäuren
II. Peptide
1. Chromatographische Trennung
a) Chromatographierpapier
b) Verteilungsmedien
c) RF-Werte
2. Identifizierung
a) Die Lokalisation der Peptide
b) Die Elution der Peptide
c) Hydrolyse
d) Endgruppenbestimmung durch Desarninierung
e) Endgruppenbestimmung mit Dinitrofluorbenzol nach Sanger
Literatur
III. Proteine und Proteide
1. Extraktion und Trennung
2. Nachweise
IV. Enzyme
1. Gewinnung der Extrakte
2. Lösungsmittel
3. RF-Werte
4. Papierelektrophorese
5. Nachweis-Reaktionen
a) Amylase
b) Phosphatase
c) Phosphorylase
d) Carbohydrasen
e) Lipase
f) Katalase
g) Esterasen
h) Proteinase
i) Pepsin
k) Peptidasen
l) Urease
m) Xanthin-Dehydrase
n) Luciferase
6. Enzymaktivität
Literatur
F. Nucleinsäuren und ihre Bausteine
I. Isolierung der Nucleinsäuren
1. Gewinnung von DNS
2. Gewinnung von RNS
3. Gewinnung von Ribonucleinproteid
II. Hydrolyse der Nucleinsäuren
1. Hydrolyse von DNS
a) Hydrolyse mit Perchlorsäure
b) Hydrolyse mit Ameisensäure
c) Hydrolyrse mit Salzsäure
d) Hydrolyse mit P2O5.
2. Hydrolyse von RNS
a) Hydrolyse zu Purin- und Pyrimidinbasen
b) Hydrolyse zu Purinbasen und Pyrimidin-Nucleotiden
c) Hydrolyse zu Nucleotiden
III. Trennung der NS-Komponenten durch Papier-Elektrophorese
1. Trennung der Basen
2. Trennung der Nucleoside und Nucleotide
3. Trennung der NS
IV. Trennung der NS-Bausteine durch Papierchromatographie
1. Lösungsmittel-Systeme
2. Papiere
3. RF-Werte
4. Nachweisreaktionen
a) Nachweis durch Ultraviolett-Absorption
b) Dische-Reagens
c) Modifiziertes Dische-Reagens
d) Orcein-Perchlorsäure-Reagens
e) Hanes-Isherwood-Reagens
f) Eisenchlorid-Sulfosalicylsäure-Reagens für Nucleotide
g) Perjodatreagens für Nucleoside
h) Quecksilber-Nitrat-Reagens für Purin-Basen
V. Quantitative Technik
Literatur
G. Pflanzenviren
I. Einführung
II. Gewinnung geeigneter virushaltiger Lösungen
III. Der chromatographische Vorgang
IV. Lokalisierung der Viren im Chromatogramm
V. Papierelektrophorese
VI. Ausbaumöglichkeiten
Literatur
H. Farbstoffe
I. Die Chloroplastenfarbstoffe
1. Extraktion der Chloroplastenfarbstoffe
2. Die Auftragung des Extraktes
3. Die Trennung der Farbstoffe am Papier
4. Das Eluieren und Bestimmen der Farbflecke
5. Besondere Arbeitsmethoden
6. Trennung der Chloroplastenfarbstoffe an Glasfaserpapier
Literatur
II. Zellsaftlösliche Pigmente (Anthocyane und Flavonoide)
1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials
2. Lösungsmittel
3. Chromatographische Technik
4. Nachweisreagentien
a) Alkalische Reagentien
b) Eisen-III-chlorid
c) Aluminiumchlorid
d) Andere Metallsalze
e) Benedikts Reagens
f) Borsäure und aromatische Borsäuren
g) Azo-Reaktionen
h) Reduktionsproben
5. RF-Werte
6. Vergleichssubstanzen
7. Anwendungsbeispiel
a) Chromatographische Fraktionierung
b) Qualitative Hydrolyse
c) Quantitative Hydrolyse
d) Stellung der Zuckerreste im Molekül
Literatur
J. Wirkstoffe
I. Wachstumsregulatoren und verwandte Stoffe
1. Analyse von bekannten Stoffen
a) Geräte
b) Papiere
c) Lösungsmittel
d) Nachweisreaktionen
e) Die Reagentien
2. Analyse von unbekannten Substanzen
a) Extraktionsmethode
b) Fraktionierung
c) Entfernung von Störstoffen
d) Präparative Fraktionierung
e) Bioautographie
f) RF-Werte nicht identifizierter Wachstumsregulatoren
g) Fehlerquellen
3. Quantitative Bestimmungen
a) Mikrochemische Methoden
b) Biologischer Test
4. Molekulargewichts-Bestimmungen
5. "Tracer"-Methodik
6. Papierelektrophorese
Literatur
II. Vitamine
1. Vitamine des B-Komplexes
a) Thiamin
b) Riboflavin
c) B6-Gruppe
d) Nicotinsäure
e) Pantothensäure
f) Cobalamine
g) p-Aminobenzoesäure (PABS) und die Folsäure-Gruppe
h) Biotin
2. Ascorbinsäure (Vitamin C)
a) Extraktgewinnung
b) Lösungsmittel
c) Nachweisreagentien
d) Quantitative Methoden
3. Tokopherole (Vitamin E)
Literatur
K. Hemmstoffe
I. Antibiotica
1. Vorbereitung der Proben
2. Material und Arbeitsbedingungen
a) Papier
b) Lösungsmittel
c) Besondere Versuchsbedingungen
3. RF-Werte und Positions-Konstanten
4. Nachweismethoden
a) Mikrobiologischer Nachweis
?) Versuchsgefäße
?) Testorganismen
?) Nährböden
?) Vorbereitung der Versuchsplatten
?) Nachweisverfahren
b) Farbnachweise
?) Für Streptomycine
?) Für Chloromycetin und seine Abbauprodukte
?) Für Tetracycline
?) Für N-Acetyl-Neomycin
c) Fluorescenz-Nachweise
d) Radiographischer Nachweis
e) Nachweise mittels Aminosäuren
5. Quantitative Bestimmung
6. Sammel-Chromogramme (summarized papergrams)
7. Elektrophorese
Literatur
II. Toxine
1. Diaporthin
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Nachweis
2. Enniatine
a) Aufarbeitung
b) Hydrolyse der Enniatinpräparate
c) Chromatographie
d) Nachweis
3. Fusarinsäure
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Qualitativer Nachweis
d) Quantitative Bestimmung
4. Helminthosporium victoriae-Toxin
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Nachweis
5. Lycomarasmin
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Nachweis
6. Patulin
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Qualitativer Nachweis
d) Quantitativer Nachweis
7. Wildfire-Toxin
a) Aufarbeitung
b) Chromatographie
c) Nachweis
Literatur
L. Aldehyde und Ketone
I. Extraktion und Umsetzung
II. Trennung
III. Nachweis
IV. Quantitative Bestimmung
V. Papierelektrophorese
Literatur
M. Phenolische Verbindungen und Gerbstoffe
I. Extraktion
II. Lösungsmittel
III. RF-Werte
IV. Papierelektrophorese
V. Nachweisreaktionen
VI. Quantitative Bestimmung
Literatur
N. Organische Basen
I. Amine
1. Aufarbeitung des Pfianzenmaterials
2. Beste Technik
3. Laufmittel
4. Papiersorten
5. Qualitativer Nachweis und Nachweisgrenzen der Amine auf dem Chromatogramm
a) Primäre Amine
b) Sekundäre Amine
c) Tertiäre Amine
d) Alkanolamine
e) Ammoniak
6. Quantitative Methoden
7. Weitere Identifizierungsmöglichkeiten der Amine
a) 2,4-Dinitro-?-naphthol (DNN-) Verbindungen der Amine
b) Die Identifizierung der einzelnen Amine
Literatur
II. Alkaloide
1. Allgemeine Nachweisreaktionen
a) Dragendorff-Reagens
b) Munter-Reagens
c) Reagens nach Thies und Reuther
d) Reagens nach Massicot
e) Molvbdänblau-Reaktion
f) Reagens nach Reindel und Hoppe
g) Joddämpfe
2. Vorbereitung der Proben
3. Trennungsmethoden
a) Tropanalkaloide
?) Atropin-Typ
?) Cocain-Typ
b) Tabak-Alkaloide
c) Conium-Alkaloide
d) Alkaloide aus Punica granatum
e) Lobelia-Alkaloide
f) Sedum-Alkaloide
g) Lupinen-Alkaloide und verwandte Leguminosen-Alkaloide
h) China-Alkaloide
i) Opium-Alkaloide
j) Berberin-Typ
k) Yohimbin-Typ
l) Rauwolfia-Alkaloide
m) Strychnos-Alkaloide
n) Kalebassen-Curare
o) Mutterkorn-Alkaloide
p) Solanum-Alkaloide
q) Veratrum-Alkaloide
r) Pilocarpin-Gruppe
s) Xanthin-Derivate (und Trigonellin)
t) Colchicum-Alkaloide
u) Bärlapp-Alkaloide
v) Ephedrin
Literatur
O. Sterine, Steroide und verwandte Verbindungen
I. Aufschluß und Extraktion
1. Unpolare, neutrale Steroide
2. Glykoside und Aglykone
II. Adsorptions- und Verteilungschromatographie
1. Adsorptionschromatographie
2. Verteilungschromatographie
III Papierchromatographie
IV. Die Lösungsmittelsysteme
1. Unpolare Sterine
2. Glykoside und Aglykone (Cardenolide)
3. Glykoside und Aglykone (Butadienolide)
P. Nachweis der Steroide durch Farbreaktionen
a) Phosphorsäure
b) Trichloressigsäure
c) Antimontrichlorid
d) 3,5-Dinitrobenzoesäure
e) Dragenaadorffs Reagens
f) Zinntetrachlorid
Literatur
Fachausdrücke der Papierchromatographie.